Çalışmanın omurgasında PACE (phage-assisted continuous evolution) adı verilen ve seçilim baskılarını deneysel olarak kontrol edebilen bir evrim platformu var. Bu sistemde araştırmacılar, botulinum nörotoksiniyle ilişkili bir proteaz olan BoNT/E’yi, seçilim koşullarına yanıt verecek şekilde evrimleştiriyor. Ancak proje, standart “vahşi tip” (WT) enzimin takibini yapmanın ötesine geçiyor: Yapay zekâyla üretilen farklı yeniden tasarımların, evrim sırasında hangi mutasyonların bir avantaj sağlayıp sağlamadığını etkileyip etkilemediği sorusu araştırmanın merkezinde yer alıyor.

Bilimsel problem, protein yeniden tasarımlarında sıklıkla görülen bir trade-off’tan kaynaklanıyor. Çok sayıda yeniden tasarım yaklaşımı, proteini daha kararlı hale getirerek hatalı katlanmayı ve dayanımı artırabilir; fakat bu stabilite kazanımı, enzimin katalitik performansını düşürme eğiliminde olabilir. Bu nedenle araştırmacılar, “yüksek stabiliteye sahip ama kinetik açıdan zayıf” bir başlangıç taşıyan bir proteazın, yine de PACE evrimi sırasında WT’nin önüne geçip geçemeyeceğini test ediyor.

Deneylerde başlangıç örneği olarak ProteinMPNN redesign D4 kullanılıyor. D4, ilk aşamada hücre/konak sisteminde iyi bir şekilde ifade ediliyor; ancak substratı kesme hızı WT’ye kıyasla yaklaşık 20 kat daha yavaş. Buna karşın D4’ün erime sıcaklığının (melting temperature) daha yüksek olması, tasarımın stabiliteyi artırdığını düşündürüyor. Yani yeniden tasarım, “daha az iş yapan ama daha dayanıklı” bir protein prototipi sunuyor. Araştırmacıların temel merakı ise bu kinetik darboğazın evrimle aşılıp aşılmayacağı ve hangi rotanın tercih edileceği.

Çalışmanın yaklaşımı, PACE boyunca seçilim baskısının, mutasyonların etkisini nasıl şekillendirdiğini incelemeye dayanıyor. Eğer belirli bir başlangıç proteininin yapısal özellikleri, potansiyel mutasyonların erişilebilirliğini ve etkisini değiştiriyorsa, bu durum fitness peyzajında ölçülebilir farklılıklara yol açabilir. Başka bir deyişle, aynı genetik alan içinde bile farklı başlangıçlar, evrimin “doğru” mutasyonlara daha hızlı ulaşmasını sağlayabilir ya da tersine daha uzun süreler gerektirebilir.

Bu çerçevede araştırmacılar, AI yeniden tasarımlarının yalnızca enzim aktivitesini başlangıçta nasıl etkilediğini değil, evrim sürecinde hangi mutasyon sınıflarının faydalı hale geldiğini de karşılaştırıyor. Elde edilen gözlemler, yeniden tasarımın evrimsel kuralları otomatik olarak kilitlemediğini, fakat bazı mutasyonların başarı olasılığını artırarak başlangıç koşullarını “hızlandırıcı bir konuma” taşıyabildiğini vurguluyor. D4 örneği özelinde, kinetik olarak zayıf olmasına rağmen evrimle kazanım elde edilebiliyorsa, bu durum stabiliteyi hedefleyen tasarımların “mutlak bir engel” değil, doğru seçilim düzeniyle birlikte daha verimli keşif pencereleri açabilen bir zemin olabileceğini gösterir.

Makalenin verdiği mesaj, protein evrimini yeniden tasarım stratejisinden ayrı düşünmenin sınırlı kalabileceği yönünde. AI tabanlı yeniden tasarımlar, yalnızca nihai hedefe götürmek yerine, PACE gibi deneysel evrim sistemlerinde arama uzayını yeniden şekillendirerek yüksek işlevli enzim varyantlarını daha hızlı bulmaya yardımcı bir “boosted starting point” işlevi görebilir. Bu yaklaşım, proteinlerin evrilebilirliğinin (evolvability) çevresel/deneysel koşullarla birlikte ele alınması gerektiğini; fitness peyzajlarının da başlangıç noktalarına duyarlı olabileceğini güçlendiriyor.

BoNT/E proteazı gibi biyomedikal açıdan hassas bir hedef üzerinde yapılan bu çalışma, laboratuvarda kontrollü evrim ile AI tasarımlarını aynı çerçevede birleştirmenin potansiyelini bilimsel olarak test ediyor. Önümüzdeki adımlar, hangi yeniden tasarım özelliklerinin evrimsel rotaları en iyi şekilde değiştirdiğini daha sistematik biçimde anlamaya ve farklı enzim sınıflarında benzer “başlangıç zeminleri”nin ne ölçüde genellenebileceğini araştırmaya odaklanabilir.

Cytochrome P450 enzimleri, özellikle oksidatif reaksiyonlardaki rolleriyle tanınıyor. Bu proteinler, heme adı verilen demir içeren bir kofaktörü kullanarak karmaşık molekülleri dönüştürüyor; pek çok türde ilaç metabolizması, doğal ürün biyosentezi ve hidroksilasyon reaksiyonlarında görev alıyorlar. Yıllardır bu enzimlerin ayırt edici özelliği, heme grubunun demirine alttan bağlanan proksimal sistein tiolatının varlığı olarak kabul ediliyordu. Bu bağın, P450’lerin olağanüstü katalitik gücünü sağlayan temel unsur olduğu düşünülüyordu. Yeni çalışma ise bu kabulü daha esnek bir çerçeveye oturtuyor.

Nature Chemical Biology’de yayımlanan araştırmada, bilim insanları çok sayıda mikrobiyal genomu tarayarak sistein içermeyen P450 homologlarını sistematik biçimde aradı. Biyoinformatik analizler sonucunda, ortak P450 mimarisine sahip ancak klasik heme-bağlanma bölgesinde korunmuş sisteini taşımayan 20 ayrı aile tanımlandı. Bu ailelerin her biri, heme koordinasyonu için farklı sekans özellikleri gösteriyor ve bu da yalnızca tek bir evrimsel sapmadan değil, birden fazla bağımsız değişim hattından söz edildiğini düşündürüyor.

En dikkat çekici bulgulardan biri, bu alışılmadık enzimlerde proksimal koordinasyonun yalnızca alternatif amino asitlerle değil, bazı durumlarda selenosistein ile de sağlanabiliyor olması. Serin ve selenosistein gibi kalıntıların heme demirine bağlanma biçimi, P450 kimyasının klasik sistein modeli dışında da işleyebileceğini ortaya koyuyor. Bu durum, enzimin aktif merkezindeki elektron dağılımının ve reaktivitenin beklenenden daha çeşitli yollarla ayarlanabildiğini düşündürüyor. Araştırmanın ana sonucu, P450 ailesinin “sistein zorunluluğu” üzerine kurulu tanımının artık tüm üyeler için geçerli olmadığını gösteriyor.

Çalışma yalnızca bir sınıflandırma egzersizi değil; aynı zamanda enzim evrimi açısından da önemli sorular ortaya çıkarıyor. Farklı mikrobiyal soy hatlarında görülen bu alternatif heme koordinasyonlarının, çevresel baskılar altında mı seçildiği, yoksa henüz tam anlaşılmamış biyokimyasal nişlere uyumun bir sonucu mu olduğu henüz net değil. Bununla birlikte, bir enzimin temel katalitik mimarisinin bu kadar geniş bir çeşitlilik gösterebilmesi, doğanın protein mühendisliği açısından ne kadar yaratıcı olabildiğini gösteriyor. Bu çeşitlilik, tek bir yapısal motife bağlı kalmadan benzer kimyasal görevlerin yerine getirilebildiğine dair güçlü bir örnek sunuyor.

Cytochrome P450 ailesi uzun zamandır yalnızca akademik merak konusu değil; ilaç metabolizması ve mikrobiyal biyokimya açısından da merkezi öneme sahip. Bu nedenle ncCYP olarak adlandırılan yeni enzim sınıfının tanımlanması, ileride biyoteknoloji ve enzim tasarımı alanlarında yeni araştırma yolları açabilir. Özellikle farklı heme koordinasyonlarıyla çalışan proteinlerin nasıl stabilize olduğu, hangi redoks özelliklerini taşıdığı ve hangi substratları tercih ettiği soruları, yeni deneysel çalışmaların odağına yerleşebilir. Ancak araştırmacılar, şu aşamada bu enzimlerin işlevsel çeşitliliği hakkında kesin hükümler vermek için erken olduğunu vurguluyor; çünkü ortaya çıkarılan veriler ağırlıklı olarak genomik ve dizi-temelli keşiflere dayanıyor.

Bu bulgular aynı zamanda protein yapısı ile fonksiyonu arasındaki ilişkinin daha dikkatli yorumlanması gerektiğini hatırlatıyor. Uzun yıllar ders kitaplarında istisnasız kabul edilen bazı biyokimyasal ilkeler, geniş ölçekli genom taramalarıyla yeniden test ediliyor. ncCYP’lerin keşfi de bu eğilimin bir parçası olarak değerlendiriliyor: Doğada neyin “kanonik” sayılacağı, çoğu zaman kapsamlı örnekleme yapılmadan tam olarak anlaşılamıyor. Mikrobiyal genomanalizlerin derinleşmesiyle birlikte, daha önce gözden kaçmış enzim ailelerinin ortaya çıkması şaşırtıcı olmaktan çıkıyor.

Araştırmanın sağladığı en önemli katkılardan biri, P450 süper ailesinin sanılandan daha geniş bir yapısal spektrum içinde varlık gösterdiğini ortaya koyması. Klasik sistein bağı, bu aile için hâlâ çok önemli bir referans noktası olsa da, artık tek olası çözüm olarak görülmüyor. Serin ve selenosistein gibi alternatif koordinasyon seçenekleri, metalloprotein kimyasının sınırlarının yeniden çizilmesine yardımcı olabilir. Bu keşif, hem temel bilimde hem de olası uygulamalı çalışmalarda yeni bir sayfa açıyor; çünkü doğanın tanıdık görünen enzim ailelerinde bile hâlâ gizli varyasyonlar barındırdığı anlaşılıyor.

Sonuç olarak, bu çalışma sitokrom P450 enzimlerine ilişkin yıllardır süregelen bir dogmayı sarsıyor ve biyokimyanın temel yapı taşlarından birine yeni bir bakış getiriyor. Mikrobiyal genomların dikkatli incelenmesi sayesinde ortaya çıkan nonkanonik P450’ler, enzim çeşitliliğinin beklenenden çok daha zengin olduğunu gösteriyor. Bundan sonraki adım, bu sıra dışı proteinlerin nasıl çalıştığını deneysel olarak ayrıntılandırmak ve doğadaki alternatif heme koordinasyonunun kimyasal mantığını çözmek olacak.